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欧洲实验室通过DNA序列重组出新冠病毒 没有临床样本也可研发疫苗

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 黄琨 • 2020-02-25 10:05:00 来源:前瞻网 E4705G0
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病毒

1月21日,生物学论文预发布平台BioRxiv发表了一篇题为Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform(利用合成基因组学平台快速重建新冠病毒)的文章,文章通讯作者为瑞士病毒和免疫学研究所Volker Thiel,包括瑞士伯尔尼大学、柏林查理大学、柏林自由大学、柏林洪堡大学和柏林卫生研究所的科学家参与了研究。

研究团队通过反向遗传学技术,成功在实验室克隆并拯救(rescue)了新型冠状病毒。利用这一研究成果,未来在没有分离病毒植株的情况下,仅凭借病毒全基因组序列就能克隆病毒,投入疫苗研究。

过去,合成基因组学的主角曾经是大肠杆菌,但在RNA病毒克隆时,因为需要先克隆病毒DNA基因组,再转录出病毒基因组RNA,时常会受到基因组大小和DNA不稳定的干扰。

尽管后来出现过成功案例,但都存在问题,使得重组冠状病毒非常麻烦。

本次研究中,研究团队转而以酵母作为合成和维持不同RNA病毒基因组的平台,也就是以酵母人工染色体的形式,在酵母中重组和存储DNA,再将其转录出来。他们试图以此建立快速、稳定和通用的RNA病毒反向遗传学管道。

首先,研究团队以含有绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠肝炎病毒(MHV)株A59作为实验对象,结果显示,在酵母中,克隆DNA得到高效组装,>90%的样本呈阳性。

病毒

在随后的转录中,病毒也成功得到拯救,且病毒中GFP与亲本病毒中的难以区分。

随后,为了解决以酵母为基础的合成基因组平台是否可以应用于冠状病毒,以及是否可以实现快速诱变,研究团队又以MERS-CoV为对象,进行分子细菌人工染色体克隆,并在过程中对其中一段DNA片段进行了修饰,引入GFP基因。

实验结果结果,病毒拯救的结果符合预期,且用重组拯救的MERS-CoV接种VeroB4细胞后,很容易检测到MERS-CoV-GFP感染的绿色荧光VeroB4细胞。

病毒

不过,与预期相比,重组的MERS-CoV和MERS-CoV-GFP的复制能力略有降低。

之后,为了验证克隆序列的稳定性,研究团队将作为克隆MHV-GFP和MERS-CoV载体的酵母传代15-17次后,发现基因组可以稳定维持,没有突变发生。

研究组随后在HCoV-229E2, HCoV-HKU1; GenBank: NC_006577, MERS-CoV-Riyadh1734-2015等多种病毒上重复了实验,都取得了成功。

病毒

在正式将酵母平台用于重组新型冠状病毒时,研究组将获得的病毒全基因序列分成14段,对其中2个由大肠杆菌克隆失败的片段使用酵母进行克隆,得到了正确组装的分子,并在之后的转录中取得成功。

此外,针对SARS-CoV-2 DNA中的5‘端和SARS-CoV以及蝙蝠上的SARS-related CoVs ZXC21/ZC45不同,研究组还对修饰了5‘端DNA进行了克隆和转录,也都取得了成功。

病毒

对于反向遗传学技术而言,研究成果证明,使用酵母平台进行病毒克隆,至少可以将病毒基因组分割成14个重叠的片段,弥补了大肠杆菌对于大型RNA病毒不稳定的缺点,且组装效率也相当显著,是的研究组在一周内就完成了新冠病毒的克隆和拯救。

就现实而言,合成基因组学方法使得卫生部门和科研机构可以在没能获得临床样本的情况下,对病毒开展研究。

此外,研究组预期,人类宿主中将出现SARS-CoV-2的序列变异和可能的表型变化。有了合成基因组学平台,现在有可能在感染性克隆中引入这种序列变异,并实时对SARS-CoV-2的进化进行功能描述。

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