研究人员使用CRISPR-HOT新技术“涂色” 可在类器官中实现快速可靠的基因敲入

CRISPR–Cas9技术彻底改变了基因组编辑，并且在类器官领域或将大有可为。然而，至今医学界仍然缺乏将外源DNA序列精确整合到人类器官中的稳健的敲入方法。

近日，来自荷兰Hubrecht研究所的Hans Clevers研究团队开发了一种CRISPR-Cas9介导的不依赖同源性的新遗传工具“CRISPR-HOT”。该方法可标记人类类器官中的特定基因，简化了类器官的基因组编辑过程，为类器官可视化研究提供了可靠的基因编辑方式。 

该研究团队于3月2日将其成果发表在了Nature Cell Biology上，题为《使用独立于同源性的CRISPR–Cas9精确基因组编辑快速高效地产生敲入式人类器官》（Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing）。

在论文中，研究人员们描述了CRISPR–Cas9介导的不依赖同源性的类器官转基因（CRISPR–HOT），它能够有效生成代表不同组织的敲入人类器官。

CRISPR-HOT避免了广泛的克隆，并且在实现将外源DNA序列精确整合到所需基因座时，胜过了同源指导修复（HDR），而无需灭活未转化细胞中的TP53——后者以前曾被用来增加HDR介导的敲入。

CRISPR–HOT用于荧光标记和可视化亚细胞结构分子，并生成针对罕见肠道细胞类型的报告基因系。使用CRISPR-HOT方法，研究人员可以轻松地将这些细胞“涂成”不同的颜色，然后对其进行识别和分析。

通过这种方法，研究人员们发现了人类肝细胞分裂的模式，其中有丝分裂纺锤体被内源性标记的微管蛋白标记，细胞膜被内源性标记的E-钙粘蛋白标记。结合微管蛋白标签和TP53敲除，表明TP53参与控制了肝细胞倍性和有丝分裂纺锤体保真度——当敲除癌症基因TP53后，异常肝细胞的非结构化分裂会更频繁。

结果显示，正常肝细胞的分裂非常有序，总是沿某个方向分裂为两个子细胞。该研究发现了形成异常肝细胞的几个区域，并第一次观察到正常肝细胞如何转变为异常肝细胞。

参考来源：Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing, Nature Cell Biology,2020

https://www.nature.com/articles/s41556-020-0472-5

HOT’ CRISPR Tool Creates Fast and Efficient Knock-Ins

https://www.genengnews.com/news/hot-crispr-tool-creates-fast-and-efficient-knock-ins/