用基因“拼图”！欧洲首次人工合成活的新冠病毒，一周之内可大量生产

反向遗传学是一种不可或缺的工具，它彻底改变了对病毒发病机制和疫苗开发的认识。

目前，人们已经能够做到利用基因工程对自然界所存在的病毒进行一定程度的改造，使病毒能够为人所用，甚至“以毒攻毒”，为人类医疗做贡献。

例如，去年清华大学的研究团队就在《自然》发表了一篇论文，是将自然界存在的一些致病力较弱的病毒基因改造后制成特殊的溶瘤病毒，能够选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞。

但从头开始“重建”病毒则是另一个问题。

2002年，美国纽约州立大学石溪分校的科学家仅利用邮购的基因组序列信息和原材料、以及从网上下载的配方，首次在试管中合成出了小儿麻痹症病毒。

由于RNA相对不够稳定，研究人员利用一些邮购的原料合成出DNA分子后，又用一种酶将其转录成小儿麻痹症病毒的RNA。当这些RNA被放入装有特定化合物和酶的试管中后，它们开始自行复制，最终形成大量病毒。

不过，脊髓灰质炎病毒为20～30纳米大小的小核糖核酸病毒，而冠状病毒则在病毒中属于“大块头”(新冠病毒的大小约为125纳米)。所以，人工重组新冠病毒会更加困难。这类大型RNA病毒基因组在大肠杆菌中克隆和操作起来很麻烦，它们体积庞大，而且偶尔会出现不稳定性。

近日，发表在《自然》上的一篇论文“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”展示了一个基于酵母菌的合成基因组学平台的完整功能，它可以从基因上重建多种RNA病毒，包括冠状病毒科、黄病毒科和副黏病毒科的成员。

黄病毒属病毒粒子直径约为40-50nm，副黏病毒则通常直径150nm-350nm，也属于大型病毒。这一研究表明，该平台也有望用于寨卡病毒、仙台病毒、腮腺炎病毒、黄热病毒等的人工合成。

论文通讯作者为瑞士伯尔尼大学病毒学与免疫学研究所的Volker Thiel以及该校兽医学院传染病与病理生物学学系的Joerg Jores。此前该论文已发表在预印本网站BioRxiv上。

具体而言，研究团队将病毒基因组分成12个片段，大小在0.5kbp-3.4kbp。为了便于血清学诊断和在细胞培养时追踪，研究团队又在其中插入了表达GFP(绿色荧光蛋白)的片段，共计14个片段，交由试剂公司在大肠杆菌中化学克隆合成。

研究团队利用转化偶联重组技术 (TAR)，用酵母菌的同源重组系统依据末端重复的序列，将这些DNA序列拼到一起。获得完整的病毒序列后，用T7 RNA聚合酶将这一DNA序列转录为有感染性的病毒RNA。

随后，研究团队将该RNA用电穿孔技术导入到VeroE6(猴肾细胞)中，使得细胞被感染并发出荧光。培养这些细胞的上清液(含释放出的病毒颗粒)注入到别的培养基中，可以感染别的细胞。

(用于克隆rSARS-CoV-2、rSARS-CoV-2-GFP和synSARS-CoV-2-GFP的SARS-CoV-2基因组组织和DNA片段的示意图。)

(图：从酵母克隆1.1、2.2和3.1中提取rSARS-CoV-2，从酵母克隆4.1、5.2和6.2中提取rSARS-CoV2-GFP。)

转化偶联重组技术 (TAR)是一种十分成熟的大片段DNA克隆技术，近年来广泛应用。它是基于含同源序列的DNA片段的自由末端在酵母细胞内能够高效同源重组的原理而建立。该技术可从复杂基因组中选择性分离目标DNA，且操作简便，实验周期短。

20世纪80年代，科学家首次证明在酵母细胞内两个含同源序列的DNA分子可以同源重组，并将其开发用于更普遍的DNA体内连接或拼接，后被命名为TAR克隆技术。

除了新冠病毒以外，研究团队还给出了对其他34种RNA病毒全合成的技术细节。

研究人员表示，基于这个平台，能够在收到合成的DNA片段后的一周内，对最近流行的SARS-CoV-2病毒设计进行化学合成克隆，并使其复活。这一过程无需从病人样本中提取完整病毒。

在传染病迅速散播开来的情况下，在一周之内大量人工生产出有活性的病毒，将有利于科学界对新出现的病毒做出快速反应，在暴发期间实时地生成和描述进化的RNA病毒变种的功能，为研究扫清障碍，同时也能依据需求改造出实验所需的病毒工具。

参考资料：

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2294-9

http://news.bioon.com/article/6746553.html

http://tech.sina.com.cn/o/2002-07-13/125845.shtml

https://max.book118.com/html/2018/0731/6222140155001210.shtm